一、原理
本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在微孔条上预包被偶联抗原，样本中的残留物青霉素将和微孔条上预包被的偶联抗原竞争青霉素抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样本吸光值与其所含残留物青霉素的含量成负相关，与标准曲线比较可得出相应残留物青霉素的含量。
二、试剂盒特性
试剂盒灵敏度： 0.05ppb
样本定量检测下限
组 织———————1ppb
蜂蜜、牛奶—————————————1ppb
交叉反应率
青霉素——————100%
氨苄青霉素———————0.8%
邻氯青霉素—————————0.2%
双氯青霉素——————————————0.1%
阿莫西林—————————0.1%
头孢塞呋—————————0.1%
样本回收率
组 织——————————————85±10%
蜂蜜、牛奶————————————70±10%
三、 试剂盒组成
1、 微量测试孔：每条8孔，一板12条
2、 标准液×6瓶：（1ml/瓶）0ppb、0.05 ppb、0.15 ppb、0.45ppb、1.35ppb、4.05 ppb
3、 酶标记物 12ml ……………红色帽
4、 抗体工作液 7ml ……………蓝色帽
5、 底物 A 液 7ml……………白色帽
6、 底物 B 液 7ml ……………黑色帽
7、 终止液 7ml ……………黄色帽
8、 20X浓缩洗涤液 40ml …………白色帽
9、 2X浓缩复溶液 50ml …………透明帽
四、所用仪器、试剂
具备的仪器：微孔板酶标仪、旋转蒸发仪/氮
气吹干装置、均质器、振荡器、
离心机、刻度移液管、天平（感量0.01g）
微量移液器：单道 20µl-200µl、100µl-1000多道250µl
试 剂：氢氧化钠、乙腈、正己烷、去
离子水、亚硝基铁氰化钠、硫酸锌、2M H2SO4、浓盐酸
五、样本前处理步骤
样本处理前须知
处理任何样本时，都必须注意：
（a）本试剂盒所检测的组织样本包括：动物组织、禽类和水产组织。eg:鸡、鸭、牛、羊、兔、鱼、虾等。
（b）实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。
（c）实验之前须检查各种实验器具是否干净，必要时可对实验器具进行清洁，以避免污染干扰实验结果。
样本前处理需配制：
配液1、用去离子水将2×浓缩复溶液按1：1稀释（1份浓缩复溶液+1份去离子水）用于样本复溶。
配液2、0.1M NaOH溶液
0.4gNaOH加去离子水100ml溶解。
配液3、乙腈-0.1MNaOH溶液
84ml乙腈16ml 0.1M NaOH混合均匀。
配液4、C液： 0.36M 亚硝基铁氰化钠
（Na2Fe（CN）5·NO·2H2O）
称取10.7g亚硝基铁氰化钠加入去离子
水100ml溶解。
配液5、 D液：1M硫酸锌（ZnSO4·7H2O）
28.8g硫酸锌加入去离子水100ml溶解。
配液6、酸化乙腈溶液
100ml乙腈加入150µl 2M H2SO4混合均匀。
配液7、1M盐酸溶液
41.7ml浓HCL加入去离子水定容至500ml混匀。
配液8、1M NaOH溶液
4g NaOH加去离子水100ml溶解。
（a）组织（鸡、鸭、猪肉/猪肝、虾、鱼）前处理方法
1、 用均质器均质组织样本；
2、 称取2±0.05g于50ml离心管中，加入8ml乙腈-0.1M NaOH溶液，涡旋2min，振荡5min，室温4000r/min以上，离心10min；
3、 取出1ml上清液，在56℃条件下氮气或空气流吹至*干燥；
4、 加入1 ml正己烷溶解干燥残留物，再加1ml稀释后的复溶液充分混匀30s，室温4000r/min以上，离心5min；
5、 去除上层正己烷相，下层水相按1：4（50µl样本液加200µl稀释后的复溶液）稀释，混合30s；
6、 取50 µl用于分析。
样本稀释倍数：20
（b）蜂蜜
1、 准确称取4±0.05g蜂蜜样本于离心管中，加入0.5ml 1M NaOH振荡混匀后静置20min；
2、 加入0.5ml 1M HCl，振荡混匀（pH应在3左右，若没在此范围请用盐酸或氢氧化钠调至准确），再加入7ml酸化乙腈（pH4.0左右），充分振荡5min，室温4000r/min 以上离心10min；
3、 取上清液3ml，在56℃条件下氮气或空气流吹至*干燥；
4、 加1ml稀释后的复溶液溶解干燥残留物；
5、 取液体用稀释好的复溶液按1：19（20µl样本液+380µl稀释后的复溶液）稀释，混合30s；
6、 取50µl用于分析。
样本稀释倍数：20
（c）牛奶
牛奶样本处理方法一
1、 取2ml鲜牛奶于5ml离心管，加入50µlC液混匀；
2、 加入50 µl D液振荡1min，10℃ 4000r/min以上离心10min；
3、 取上层清亮液体用稀释好的复溶液按1： 19（20µl样本液+380µl稀释后的复溶液）稀释，混合30s；
4、 取50µl用于分析。
注：如果离心后仍然浑浊，再重复沉淀过程。
样本稀释倍数：20
牛奶样本处理方法二
1、 取2ml去除脂肪奶样至离心管中；
2、 加入8ml乙腈-0.1M NaOH充分振荡5min，15℃ 4000r/min以上离心10min，取1ml上清液，在56℃条件下氮气或空气流吹至*干燥；
3、 用1ml正己烷溶解干燥的残留物后，再加入1ml稀释后的复溶液混合30s，离心去除正己烷相；
4、 取下层相用稀释好的复溶液按1：3 （50µl样本液加150µl稀释后的复溶液）稀释，混合30s；
5、 取50µl用于分析。
样本稀释倍数：20
六、 酶标免疫分析程序
测定前应须知：
1、 使用之前将所有试剂和需用板条的温度回升至室温（20-25℃）。
2、 使用之后立即将所有试剂放回2-8℃。
3、 在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是ELISA测定程序中的要点。
4、 在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖板膜封住微孔板。
操作步骤：
1、 从4℃冷藏环境中取出所需试剂，置室温（20-25℃）平衡30min以上, 注意每种液体试剂使用前均须摇匀。
2、 取出框架及需要数量的微孔，将不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。
3、 配液：将40ml浓缩洗涤液（20倍浓缩）用去离子水按照1：19稀释（1份浓缩洗涤液+19份去离子水），或按所需用量配制洗涤液。
4、 编号：将样本和标准品对应微孔按序编号,每个样本和标准品做2孔平行,并记录标准孔和样本孔所在的位置。
5、 加标准品/样本50µl/孔到各自的微孔中，然后加抗体50µl/孔，用盖板膜封板，轻轻振荡混匀。37℃环境中反应30min。
6、 取出将孔内液体甩干，用洗液250µl/孔，洗板4-5次，每次间隔15-30秒，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。
7、 每孔加入酶标记物100µl，盖板膜盖板后置37℃环境中反应30min。将孔内液体甩干，用洗涤液充分洗板4-5遍（同上），用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。
8、 显色：每孔加入底物A液50µl，再加底物B液50µl，轻轻振荡混匀，37℃环境中避光显色15min。
9、 测定：每孔加入终止液50µl，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测，在5min内读完数据），测定每孔OD值。
七. 结果判定
结果判定有两种方法,粗略判定可用第1种方法,定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与青霉素的含量成负相关。
1、 粗略判定
用样本的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围（ppb）。假设样本1的吸光度值为0.310，样本2的吸光度值为0.820，标准液吸光度值分别是：0ppb为1.610；0.05ppb为1.350；0.15ppb为1.030；0.45ppb为0.660；1.35ppb为0.389；4.05ppb为0.198。则样本1的浓度范围是1.35ppb-4.05ppb；样本2的浓度范围是0.15 ppb-0.45ppb。再乘以其对应的稀释倍数即为样本中青霉素实际浓度。
2、 定量分析
（1）百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值（双孔）除以*个标准（0标准）的吸光度值，再乘以100%，即
| 百分吸光度值（%）＝ | B | ×100% |
| B0 |
B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值
B0—0ng/ml标准溶液的平均吸光度值
（2）标准曲线的绘制与计算
以标准品百分吸光率为纵坐标，以青霉素标准品浓度（ng/ml）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中青霉素实际浓度。
若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样本的准确、快速分析。（索取）
八. 注意事项
1、 室温低于20℃或试剂及样本没有回到室温（20-25℃）会导致所有标准的OD值偏低。
2、 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会伴随着出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。
3、 试剂混合要均匀，否则会出现重复性不好的现象。
4、 反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。
5、 不要使用过了有效期的试剂盒，稀释或搀杂使用会引起灵敏度、OD值的变化。不要交换使用不同批号的盒中试剂。
6、 试剂变质的迹象
显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。0标准的吸光度值小于0.5个单位（A450nm<0.5 ）时，表示试剂可能变质。
7、 加A、B 液后一般显色15min即可，若颜色较浅，可延长显色时间，但不能超过30min。
8、 该试剂盒*反应温度为37℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。
九、储藏条件和保质期
储藏条件：试剂盒于2-8℃保存，不要冷冻。
保 质 期：该产品有效期为1年，生产日期见包装盒。
提示：酶标板真空包装袋若有漏气，酶标板仍然正常有效，不影响实验结果，请放心使用。
